3.2.4 Mikrojádra |
Mikrojádra jsou malé kulaté struktury viditelné v buněčné cytoplazmě během interfáze s podobnými charakteristikami barvení jaké vykazuje hlavní buněčné jádro. Obsahují buď celé chromozomy nebo chromozomální fragmenty, které zůstávají během mitózy stranou. Jelikož se fragmenty obvykle tvoří společně s dicentrickými chromozomy a kroužky, je zvýšená frekvence mikrojader indikátorem ozáření, podobně jako je tomu se zvýšenou frekvencí nestabilních chromozomálních aberací. Vzhledem k této souvislosti rovněž není překvapivé, že lymfocyty s mikrojádry vymizí z periferní krve s poločasem zhruba 3 roky. Pro pozorování mikrojader byly lymfocyty stimulovány jako v případě analýzy chromozomálních aberací. Protože se některá mikrojádra vyskytují spontánně v neproliferujících lymfocytech, je třeba zajistit, že se analyzují pouze buňky, které prošly mitózou. Toho se dosahuje pomocí cytochalasinu B, který se ke kulturám přidává 48 h po stimulaci na dobu 24 h a umožňuje pokračování jaderného dělení při prevenci dělení buněk. Buňky, které dokončily mitózu, mohou být proto rozpoznány jako buňky se dvěma jádry (binukleární buňky).
Mikrojádro, detekce na konci mitotického dělení Obvyklá frekvence mikrojader bez ozáření je 1 na 100 binukleárních buněk, a tato frekvence roste s dávkou záření lineárně-kvadratickým způsobem. Při 100 mGy je indukována další 1 ze 100, což je statisticky rozdílné oproti pozadí při počtu obvykle 500 buněk. Citlivost metody lze zvýšit analýzou pouze těch mikrojader, které obsahují fragmenty (což je obvykle výsledkem zlomů DNA během radiace) a vyloučením těch, které obsahují celé chromozomy (které obvykle nesouvisí s ozářením). Tyto dva typy lze rozlišit značením protilátkami specifickými pro centromery (centrální část chromozomu), kde neoznačená mikrojádra zřejmě obsahují pouze fragmenty. Při tomto způsobu se uvádí minimální detekovatelná dávka okolo 50 mGy.
Mikrojádra, obsahující pouze fragment chromozomu (neoznačené, nalevo) nebo cely chromozom (označené protilátkami specifickými pro centromery, napravo) V případě mikrojader je další možností automatizace. Dosud není k dispozici program, který by spolehlivě detekoval dicentrické chromozomy a kroužky. Automatická detekce mikrojader v binukleárních buňkách je mnohem jednodušším úkolem. Nevýhodou je zde ovšem požadavek dokonalého vybavení mikroskopu stejně tak jako potřebné programové vybavení. Vzhledem k vyššímu počtu buněk, které lze analyzovat, je minimální detekovatelná dávka opět okolo 50 mGy. Třetí možnost volby je detekce mikrojader pomocí průtokové cytometrie, což je metoda pro počítání a diferenciaci tisíců buněk během několika sekund. Po příslušném barvení nebo značení prochází suspenze buněk úzkým svazkem světla. Měří se rozptyl světla a/nebo fluorescenční signály vyvolané každou jednotlivou buňkou nebo v tomto případě jednotlivým jádrem či mikrojádrem s následujícím zpracováním pro další analýzu počítačem. Kvantitativní vyhodnocení mikrojader průtokovou cytometrií naráží na určité technické obtíže u lymfocytů, avšak tato metoda byla úspěšně použita pro retikulocyty (nezralé erytrocyty), kde problémem je, že retikulocyty jsou v periferní krvi velice vzácné a mají životnost pouze několik dnů. Uvažovalo se však o tom, že by se tato metoda mohla použít pro detekci dávek pouhých 3 mGy během 24 h po expozici.
|